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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN 421 Subclasificación molecular del cáncer colorrectal - A. M. Wielandt et al Figura 1. Flujograma de pacientes con cáncer colorrectal disponibles para el análisis de las distintas vías carcinogénicas. CCR: cáncer colorrectal; CIN: inestabilidad cromosomal; MSI: inestabilidad microsatelital; CIMP: fenotipo metilador de islotes CpG; MSS, MSI estable; IHQ: inmunohistoquímica; CMS: subtipo molecular consenso. Análisis del estado CIN Se realizó un análisis de deleción de 10 STRs (short tandem repeat) aledaños a los genes APC (D5S134-D5S346-D5S656-D5S82), DCC (D18S46-D18S64-D18S69) y P53 (D17S1176- D17S1881-D17S250) mediante PCR21. Cada marcador microsatelital fue amplificado por PCR a partir de ADN tumoral y normal del mismo paciente. Se consideró LOH positivo si la altura relativa del peak del ADN tumoral disminuye 30% con respecto al ADN normal. El locus se consideró positivo si al menos uno de los marcadores informativos mostró LOH. Se considera CIN-alta si presenta sobre 3 STRs con pérdida alélica22. Análisis del estado de MSI Se determinó mediante el panel de siete marcadores microsatelitales recomendados por el National Cancer Institute (NCI) (Bat-25/Bat-26/ Bat-40/D2S123/D3S1029/D5S346/ D17S250). Cada marcador microsatelital fue amplificado mediante PCR a partir de ADN tumoral y normal del mismo paciente23. Los tumores se clasificaron en tres categorías: MSI-alta (≥ 3 marcadores inestables), MSI-baja (1-2 marcadores inestables) y MSS (sin inestabilidad). CIMP Se determinó utilizando MethyLight24 para un panel de 6 marcadores (CACNA1G/IGF2/NEUROG1/ RUNX3/SOCS1/MLH1)25,26. Las muestras de ADN tumoral fueron modificadas mediante el kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research, Irvine, AC, USA). Se utilizó como gen de referencia ALU-C4. Como control positivo se usó ADN metilado con enzima SssI metiltransferasa (Promega, Madison, WI, USA). Se consideró un gen metilado si presentaba sobre 80% de metilación respecto al ADN control. Los tumores se clasifican en 3 categorías: CIMP-alta (≥ 3 genes metilados), CIMP-baja (1 o 2 genes metilados) y CIMP-0 (sin genes metilados). Análisis de mutaciones somáticas en KRAS, BRAF y PIK3CA El ADN tumoral se analizó mediante PCR para las mutaciones más frecuentes en los genes KRAS (codón 12 y 13), BRAF (codón 600) y PIK3CA (exones 9 y 20)27. Luego fueron analizados directamente por secuenciación Sanger. Análisis de inmunohistoquímica (IHQ) La evaluación de la expresión en el tumor de las proteínas del complejo MMR: MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2 fue realizada por IHQ en tejidos FFPE23. Para la interpretación de los resultados, se consideró una variable dicotómica positiva y negativa para la presencia o ausencia de las proteínas, respectivamente. Rev Med Chile 2017; 145: 419-430


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